Cytophotométrie 

Lorsqu'une cellule est placée sous le champ d'un microscope photonique, et est éclairée avec une lumière monochromatique, cette dernière est plus ou moins absorbée par les différentes parties de la cellule. Il est possible d'exprimer quantitativement la concentration relative d'une substance contenue dans un objet biologique.(Il est possible d'évaluer les quantité d'ADN et d'ARN intracellulaire avec une lumière de l =260 nm)

Diffraction au rayons X

Permet de définir la répartition des atomes dans une molécule ou une structure moléculaire par exposition a des rayonnements X. Utilisé pour déterminer la configuration spatiale des acides nucléiques cristallisés ou de certaines protéines.

 B    Procédés chimiques

Cytochimie

Exige une fixation appropriée.

• réaction nucléale de Feulgen: réaction spécifique à l'ADN, comporte une hydrolyse acide démasquant les groupes pseudo-aldéhydiques qui réagissent avec le réactif de Schiff (fushine décolorée) en donnant un produit décoloré rouge violacé. L'ADN est appelé "Feulgen +".
• Réaction de Hotchkiss-Mac Manus: à l'acide périodique Schiff (APS ou PAS). La première étape consiste en une oxydation sélective par l'acide périodique qui produit des aldéhydes insolubles colorés en rouge par le réactif de Schiff.

Certaines techniques combinent l'utilisation de plusieurs colorants et d'enzymes hydrolytiques: vert de méthyle se fixe sur l'ADN (coloration verte), pyronine colore l'ARN en rose. En ce qui concerne les enzymes, la ribonucléase provoque l'absence de coloration rose (test de Brachet) et la désoxyribonucléase provoque l'absence de la coloration verte.

Cytoenzymologie

Ce sont des méthodes de détection des enzymes in situ qui les révèlent par leur activité et non pas par leur présence. La visualisation permet de préciser la localisation intracellulaire de l'enzyme: soit directement (oxydo-reductases), soit indirectement par coloration (hydrolases).

Immunocytochimie

Permet la détection dans les cellules de diverses molécules possédant des propriétés dites "antigéniques" par liaison avec l'anticorps correspondant. Deux méthodes existent: la méthode directe (1 seul anticorps) et la méthode indirecte (utilisation de plusieurs anticorps) qui est une méthode d'amplification

Méthodes d'extraction

Fractionnement

Utilisé pour dissocier les cellules par digestion enzymatique (trypsine, collagénase) de la substance et des jonctions intercellulaires, en présence de chélateurs du calcium (EDTA) et pour trier les différents types cellulaires en suspension. Une série de moyens permettent d'obtenir des fractionnement purs d'organites cellulaires en fonction de :

• la taille / densité (centrifugation)
• la solubilité / affinité (chromatographie de partage ou d'affinité)
• la charge électrique (électrophorèse, chromatographie sur colonne échangeuse d'ions)

Ultracentrifugation

Méthode couramment utilisée pour séparer en fonction de la taille/densité des fractions pures d'organites. Deux facteurs sont utilisés:

• la vitesse de sédimentation: centrifugations différentielles et centrifugations en gradient de sédimentation
• la densité: centrifugations en gradient de densité à l'équilibre

Chromatographie

Les constituants d'un mélange mis en solution peuvent être séparés à travers un support selon divers critères.

• chromatographie sur papier: (chromatographie de partage) déplacement selon la solubilité relative par rapport à la phase acqueuse imbibant le support et le solvant non acqueux qui migre.
• Chromatographie sur colonne: séparent les différents constituants d'un mélange placés au sommet d'une colonne immergé dans un solvant, grâce à un éluant versé dans la colonne
• Chromatographie d'affinité: la substance est isolé dans la colonne par une molécule qui interagit spécifiquement.
• Chromatographie échangeuse d'ions: permet de séparer les substances ionisables (Acides aminées, protéines)

Electrophorèse

Méthode la plus fréquemment utilisée pour séparer des molécules ionisées: AA, AN, protéines. Les molécules se déplacent a une vitesse déterminée par rapport a leur charge sur leur masse.

• Electrophorèse sur papier ou acétate de cellulose: pour les petites molécules qui migrent a une vitesse proportionnelle à leur charge sur le support (hémoglobine)
• Electrophorèse sur gel: Permet de conjuguer la mobilité électrophorétique à un effet de filtration sur gel, la taille des pores limitant la vitesse de migration. On utilise généralement des gels d'agarose ou de polyacrilamide qui se solidifient.
• Electrophorèse unidimensionnelle ou SDS-PAGE: En présence d'un agent réducteur (b mercaptoéthanol qui coupe des ponts disulfures) et le SDS (qui détruit la structure tertiaire), les protéines, déposées dans un puit du gel au pole négatif migrent vers le pole positif d'autant plus rapidement qu'elles sont petites.
• Electrophorèse unidimensionnelle par iso-electro-focalisation: Une protéines non dénaturée par le SDS possède une charge globale qui varie suivant le pH. Placées sur un gradient de pH, les molécules ionisées, sous l'effet d'un champ électrique, migrent jusqu'au point ou leur pH de surface est neutre (point isoélectrique pHi)
• Electrophorèse bi-dimentionnelle (2D-PAGE): Les protéines sont séparées par une électrophorèse IEF puis en SDS-PAGE.

A la fin de la migration les protéines sont localisée soit par coloration, soit par révélation d'une activité enzymatique, soit par autoradiographie, soit par imunoprécipitation ou encore soit par hybridation moléculaire.

Spectrophotométrie

Permet d'identifier et de doser certaines molécules par leur absorption de la lumière. Permet de connaître la Densité Optique (DO) d'une substance en solution.